Cromosoma artificial de levadura: qué es, características y procedimiento de clonación

Cromosoma artificial de levadura

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El cromosoma artificial de levadura o YAC (Yeast Artificial Chromosome) forma parte de los vectores de clonación de alta capacidad siendo, de hecho, el de mayor capacidad (200 kb – 3.000 kb). Fueron descritos por primera vez en 1983 por Murray y Szostak.

Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura (eucariota), portando un centrómero y telómeros terminales. Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.

Son utilizados en la construcción de genotecas genómicas, siendo muy extendido su uso en los primeros años del Proyecto Genoma Humano. Sin embargo, son más inestables que otros vectores como los BAC (cromosoma artificial bacteriano), que han acabado imponiéndose.

Los YAC tienen un origen de replicación relajado en procariotas, por lo que aparecen muchas copias en cada bacteria (gran utilidad para producir masivamente el vector), pero un origen de replicación estricto en levaduras, apareciendo sólo una copia por célula de levadura.

Componentes de un YAC típico

Un YAC típico tiene:

• ARS1: secuencia de replicación autónoma.
• CEN4: centrómero del cromosoma IV, permite la segregación del plásmido durante la división celular.
• TELs: secuencias teloméricas.
• HIS3, TRP1, URA3: marcadores de selección en levadura que confieren prototrofía para histidina, triptófano y uracilo.
• SUP4: cambia la mutación sin sentido ámbar (UAG) por la incorporación de tirosina. Identifica las células que incorporan el vector, ya que las células huésped que portan esta mutación ámbar, de color rosado, pasan a tener un fenotipo blanco. (Prototrofo para ade).

Procedimiento de clonación

• a) Digestión con BamHI y EcoRI. Desfosforilación de los extremos 5’. Esto linealiza el vector, dejando funcionales las secuencias teloméricas. Se eliminan los marcadores His3 y Sup4.
• b) Digestión de nuestra muestra con EcoRI. Selección de los fragmentos por electroforesis y purificación.
• c) Reacción de ligación: da una molécula con un centrómero y telómeros terminales.
• d) Se induce su entrada en células por electroporación. Se clonan en gran cantidad en bacterias. Luego se extraen, purifican y se introducen en levaduras por electroporación.
• e) Se seleccionan las levaduras que portan el vector mediante cultivo en un medio sin Trp, sin Ura, con His y con Adenina. Las colonias capaces de crecer en este medio y que tengan coloración rosada (rotura del SUP4 como consecuencia de la entrada del inserto) serán las que tengan los clones que nos interesan.
• f) El vector se comporta como un cromosoma más de la levadura.

Véase también

• Contigo
• Genoma
• Cromosoma artificial bacteriano

Referencias

• Murray AW, Szostak JW (1983): Construction of artificial chromosomes in yeast, Nature 305, 2049-2054.
• Larin Z, Monaco AP, Lehrach H (1991): Yeast artificial chromosome libraries containing large inserts from mouse and human DNA, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88, 4123-4127.
• Bellanné-Chantelot C et al. (1992): Mapping the whole human genome by fingerprinting yeast artificial chromosomes, Cell 70, 1059-1068.

Categorías

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• Clonación

Plásmido

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Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y transcriben de forma independiente del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su tamaño varía desde 1 a 250 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. El término plásmido fue presentado por primera vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952.^[1]

Las moléculas de ADN plasmídico adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas.

En general, no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo más común es el de los plásmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibiótico, de manera que el plásmido únicamente supondrá una ventaja en presencia de ese antibiótico.

Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en su interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.

Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal, así como también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias genéticas.

Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros métodos de selección además de la resistencia a antibióticos, como los basados en fluorescencia o en proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Estos nuevos métodos de selección de plásmidos son de uso frecuente en agrobiotecnología, debido a la fuerte crítica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibióticos en los organismos modificados genéticamente.

Índice

• 1 Resistencia a los antibióticos
• 2 Episomas
• 3 Tipos
• 4 Aplicaciones
• 5 Extracción del ADN plasmídico
• 6 Conformaciones
• 7 Referencias
• 8 Véase también
• 9 Enlaces externos

Resistencia a los antibióticos

Los plásmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la bacteria resistente a los antibióticos.

Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotas.

Episomas

Un episoma es un plásmido que puede integrarse por sí mismo al ADN cromosomal del organismo huésped. Por esta razón, puede mantenerse en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada división celular del huésped y volverse parte básica de su mapa genético. Este término no se usa más en plásmidos, debido a que ahora está claro que una región homóloga con el cromosoma elabora un plásmido dentro de un episoma.

Los plásmidos usados en ingeniería genética son llamados vectores. Estos son usados para transferir genes desde un organismo a otro y típicamente contienen un marcador genético confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La mayoría también contienen un polivinculador o sitio de clonado múltiple (MCS), el cual es una pequeña región que contiene los sitios de restricción más comúnmente usados, permitiendo una fácil inserción de fragmentos de ADN en ese lugar.

Tipos

Una forma de agrupar plásmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los plásmidos conjugativos contienen “tra-genes”, los cuales ejecutan complejos procesos de conjugación, como la transferencia sexual de plásmidos a otra bacteria. Los plásmidos no conjugativos son incapaces de iniciar una conjugación, de allí que ellos pueden transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos conjugativos y lo hacen “por accidente”. Una clase intermedia de plásmidos son los “movilizables”, los cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un plásmido conjugativo, transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia.

Es posible para plásmidos de diferentes tipos coexistir en una célula simple.

Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encontrados en la E. coli. Pero normalmente plásmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive en la línea celular, debido a la regulación de las funciones vitales de los plásmidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.

Otra forma de clasificar plásmidos es por función. Hay 5 clases principales:

• Plásmidos de fertilidad: contienen tra-genes y son capaces de conjugarse.
• Plásmidos de resistencia: contienen genes que pueden constituir resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.
• Col-plásmidos: contienen genes que codifican (determinan la producción de) colinas y proteínas que pueden matar a otra bacteria.
• Plásmidos degradativos: habilitan la digestión de sustancias inusuales como tolueno o ácido salicílico.
• Plásmidos virulentos: convierten la bacteria en un patógeno.

Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.

Los plásmidos solo pueden coexistir como una o más copias en cada bacteria; debido a la división celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.

Algunos plásmidos incluyen un sistema de adición o “Sistema de Muerte Postsegregacional” (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto un veneno de larga vida y un antídoto de vida corta. Las células hija que retienen una copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que falla al integrar el plásmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la célula padre. Este es un ejemplo de plásmidos como el ADN replicante.

Aplicaciones

Los plásmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de genética e ingeniería bioquímica, donde son comúnmente usados para multiplicar (hacer muchas copias de) o expresar genes particulares. Muchos plásmidos están disponibles comercialmente para dichos usos.

El gen a ser replicado se inserta en copias de un plásmido el cual contiene genes que hacen células resistentes a un antibiótico en particular. En el paso siguiente el plásmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado transformación. Luego, la bacteria es expuesta a un antibiótico particular. Solo la bacteria que toma copias del plásmido sobrevive al antibiótico debido a que el plásmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados (usados para hacer proteína) y la proteína expresada evita la acción del antibiótico. De esta forma, los antibióticos actúan como un filtro que selecciona únicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas en grandes cantidades, cosechadas y el plásmido de interés puede ser aislado.

Otro uso importante de los plásmidos es fabricar grandes cantidades de proteínas. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plásmido que encierra al gen de interés. Solo como la bacteria produce la proteína que le confiere su resistencia a los antibióticos, este también puede ser usado para producir proteínas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fácil de producir genes o proteínas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o incluso antibióticos.

Extracción del ADN plasmídico

En el maxiprep se cultivan volúmenes mucho más grandes de bacterias en suspensión. Esencialmente, este es un escalado de la preparación mini-prep, la cual es seguida por una purificación adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 – 1 mg) de ADN plasmídico muy puro.

En los últimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la extracción plasmídica a varias escalas, purezas y niveles de automatización.

Conformaciones

El ADN plasmídico puede aparecer en una de cinco conformaciones, las cuales (para un tamaño dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante la electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electroforética (velocidad para un voltaje dado), del más lento al más rápido:

• Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario.
• Lineal: el ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque el ADN era lineal in vivo. Puede modelarse como un cordón que no se ha conectado consigo mismo.
• Circular relajado: ADN que interactúa completamente con ambos filamentos sin cortar, pero que ha sido enzimáticamente “relajado”. Puede modelarse dejando un cordón relajado y luego conectándolo a sí mismo.
• Superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o superenrollado (ver más abajo), pero que tiene regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la preparación del plásmido.
• ADN superespiral: ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma de remolino, resultando en una forma compacta.

La tasa de migración de pequeños fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de altos voltajes, grandes fragmentos migran continuamente a diferentes tasas. Por lo tanto, la resolución del gel decrece con el incremento del voltaje.

A un bajo voltaje determinado, la migración de un pequeño fragmento lineal de ADN está en función de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20 kb) migran a cierta tasa sin importar la longitud. Esto es debido a que las moléculas “reptan” desde el centro de la molécula siguiendo el sentido de la matriz de gel.

La digestión restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos purificados de plásmidos. Estas enzimas rompen específicamente el ADN en ciertas secuencias cortas.

Referencias

• Klein, Donald W.; Prescott, Lansing M.; Harley, John (1999). Microbiology. Boston: WCB/McGraw-Hill.
• LEDERBERG J (1952). «Cell genetics and hereditary symbiosis». Physiol. Rev. 32 (4): pp. 403-30.

Véase también

• Conversión lisogénica
• Cósmido
• Fagémido
• Cromosoma artificial bacteriano
• Bacteria
• Prion
• Virus
• Provirus
• Viroide
• Nanobio

Enlaces externos

• Wikcionario tiene definiciones y otra información sobre plásmido. Wikcionario

Categorías

• Elementos genéticos móviles
• Biotecnología

Manipulación Genética

La manipulación genética consiste en las técnicas dirigidas a modificar el caudal hereditario de alguna especie, con fines variables, desde la superación de enfermedades de origen genético (terapia génica) o con finalidad experimental (conseguir un individuo con características no existentes hasta ese momento). Llegar a la posibilidad de realizar modificaciones en la composición hereditaria de una especie requiere una serie de pasos, de los cuales unos cuantos ya han sido dados. El primero de ellos fue el descubrimiento del cromosoma humano, formado por ácido que conforma los genes, los cuales a su vez se “ubican” en los cromosomas. Cada especie tiene un número específico de cromosomas; los humanos contamos con 23 pares, es decir, 46 cromosomas.

Hay que conocer el hecho de que la información genética es un conjunto de instrucciones que se transmiten en un único “idioma”: esto quiere decir que es universal, por lo que la diferencia entre un clavel, un rinoceronte y una persona humana es la cantidad de información.

1) Enzimas de restricción

Una enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es aquella que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.

El mecanismo de corte de ADN se realiza a través de la ruptura de 2 enlaces fosfodiéster en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de ADN. Éstos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o cohesivos/escalonados. Estos últimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontáneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercanía (apareamiento de Watson & Crick).

Restricción de SmaI dejando extremos romos. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos así el ADN vector, que sería aquel que es capaz de replicarse independientemente del ADN de la célula anfitriona en la cual crece. Dentro de este grupo de vectores están los plásmidos, moléculas circulares de ADN halladas en las bacterias.

Las enzimas de restricción que, a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizómeros. Por ejemplo, están los isoesquizómeros Asp718 y KpnI.

Tipos de enzimas de restricción

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restricción:

• Tipo 1: una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y modificación (metila). Reconoce la secuencia específica de ADN y corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan ATP para moverse en el ADN, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.
• Tipo 2: solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta característica son muy utilizadas para clonación de genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan ATP.
• Tipo 3: se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas. Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de ADN. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Sistemas de restricción-modificación (M-R)

El sistema de restricción-modificación (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de ADN exógeno (normalmente víricos) que ingresen en la bacteria, distinguiéndolo del ADN propio, análogo a un sistema inmune. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases específicas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infección del fago λ en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas “K12” y “B”). Este sistema consta de dos partes:

• Restricción: permite a la bacteria protegerse de ADN exógeno para evitar la “promiscuidad” en los intercambios genéticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriófagos que pudieran poner en peligro la individualidad genética o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a través de cortes mediante endonucleasas de restricción a los ADN exógenos que ingresen a la bacteria.
• Modificación: consiste en la introducción de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual está catalizado por una metilasa específica.

2) Clonación

La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen copias idénticas de un organismo ya desarrollado, de forma asexual. Estas dos características son importantes:

• Se parte de un animal ya desarrollado, porque la clonación responde a un interés por obtener copias de un determinado animal que nos interesa, y sólo cuando es adulto conocemos sus características.
• Por otro lado, se trata de hacerlo de forma asexual. La reproducción sexual no nos permite obtener copias idénticas, ya que este tipo de reproducción por su misma naturaleza genera diversidad.

Pero existen diferentes tipos de clonación dependiendo del nivel al que se realice, por ejemplo:

Clonación molecular

La clonación molecular se utiliza en una amplia variedad de experimentos biológicos y en aplicaciones prácticas que van desde la toma de huellas dactilares hasta la producción de proteínas a gran escala. En la práctica, con el fin de amplificar cualquier secuencia en un organismo vivo, la secuencia a clonar tiene que estar vinculada a un origen de replicación; que es una secuencia de ADN.

• Transfección: se introduce la secuencia formada dentro de células.
• Selección: finalmente se seleccionan las células que han sido transfectadas con éxito con el nuevo ADN.

Inicialmente, el ADN de interés necesita ser aislado de un segmento de ADN de tamaño adecuado. Posteriormente, se da el proceso de ligación cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector de clonación: el vector se linealiza (ya que es circular) usando enzimas de restricción y a continuación se incuban en condiciones adecuadas el fragmento de ADN de interés y el vector con la enzima ADN ligasa.

Tras la ligación del vector con el inserto de interés, se produce la transfección dentro de las células; para ello, las células transfectadas son cultivadas. Este proceso es el determinante, ya que es la parte en la que vemos si las células han sido transfectadas exitosamente o no.

Clonación celular

Clonar una célula consiste en formar un grupo de ellas a partir de una sola. En el caso de organismos unicelulares como bacterias y levaduras, este proceso es muy sencillo y sólo requiere la inoculación de los productos adecuados.

Sin embargo, en el caso de cultivos de células en organismos multicelulares, la clonación de las células es una tarea difícil, ya que estas células necesitan unas condiciones del medio muy específicas.

Una técnica útil de cultivo de tejidos utilizada para clonar distintos linajes de células es el uso de aros de clonación (cilindros). De acuerdo con esta técnica, una agrupación de células unicelulares que han sido expuestas a un agente mutagénico o a un medicamento utilizado para propiciar la selección se ponen en una alta dilución para crear colonias aisladas; cada una proviniendo de una sola célula potencialmente y clónicamente diferenciada.

En una primera etapa de crecimiento, cuando las colonias tienen sólo unas pocas células, se sumergen aros estériles de poliestireno en grasa, y se ponen sobre una colonia individual junto con una pequeña cantidad de tripsina. Las células que se clonan se recolectan dentro del aro y se llevan a un nuevo contenedor para que continúe su crecimiento.

Clonación terapéutica o andropática

La clonación terapéutica o andropática tiene fines terapéuticos, y consiste en obtener células madre del paciente a tratar, atendiendo al siguiente experimento: se toma una célula somática cualquiera del paciente a tratar, se aísla el núcleo con los cromosomas dentro y se desecha todo lo demás. Por otro lado, se obtiene un óvulo sin fecundar y se extrae su núcleo con sus cromosomas, para así introducir en éste el núcleo aislado anteriormente de la célula somática. A continuación se estimula el óvulo con el núcleo comenzando así la división celular del embrión clonado.

Este embrión será un clon del paciente a tratar. Se deja que el embrión se desarrolle hasta llegar a la fase clave: el blastocisto. En esta fase se extrae la célula madre de la masa celular obtenida que tiene el mismo ADN que el paciente, y por lo tanto no causará rechazo cuando se inyecte.

Un ejemplo de este tipo de clonación es la clonación de la oveja Dolly:

3) Alimentos transgénicos

Los alimentos sometidos a ingeniería genética o alimentos transgénicos son aquellos que fueron producidos a partir de un organismo modificado genéticamente mediante ingeniería genética. Dicho de otra forma, es aquel alimento obtenido de un organismo al cual le han incorporado genes de otro para producir una característica deseada. En la actualidad tienen mayor presencia alimentos procedentes de plantas transgénicas como el maíz, la cebada o la soja.

La ingeniería genética o tecnología del ADN recombinante es la ciencia que manipula secuencias de ADN (que normalmente codifican genes) de forma directa, posibilitando su extracción de un taxón biológico dado y su inclusión en otro, así como la modificación o eliminación de estos genes. En esto se diferencia de la mejora clásica, que es la ciencia que introduce fragmentos de ADN (conteniendo, como en el caso anterior, genes) de forma indirecta, mediante cruzamientos dirigidos. La primera estrategia, la de la ingeniería genética, se circunscribe en la disciplina denominada biotecnología vegetal. Cabe destacar que la inserción de grupos de genes mediante obtención de híbridos (incluso de especies distintas) y otros procesos pueden realizarse mediante técnicas de biotecnología vegetal que no son consideradas ingeniería genética, como puede ser la fusión de protoplastos.

Beneficios: los caracteres introducidos mediante ingeniería genética en especies destinadas a la producción de alimentos buscan el incremento de la productividad (por ejemplo, mediante una resistencia mejorada a las plagas), así como la introducción de características de calidad nuevas. Debido al mayor desarrollo de la manipulación genética en especies vegetales, todos los alimentos transgénicos corresponden a derivados de plantas. Por ejemplo, un carácter empleado con frecuencia es la resistencia a herbicidas, puesto que de este modo es posible emplearlos afectando sólo a la flora ajena al cultivo. Cabe destacar que el empleo de variedades modificadas y resistentes a herbicidas ha disminuido la contaminación debida a estos productos en acuíferos y suelo, si bien es cierto que no se requeriría el uso de estos herbicidas tan nocivos por su alto contenido en glifosato (GLY) y amonio glufosinato (GLU) si no se plantaran estas variedades, diseñadas exclusivamente para resistir a dichos compuestos.

Las plagas de insectos son uno de los elementos más devastadores en agricultura. Por esta razón, la introducción de genes que provocan el desarrollo de resistencia a uno o varios órdenes de insectos ha sido un elemento común a muchas de las variedades patentadas. Las ventajas de este método suponen un menor uso de insecticidas en los campos sembrados con estas variedades, lo que redunda en un menor impacto en el ecosistema que alberga al cultivo y en la salud de los trabajadores que manipulan los fitosanitarios.

Tecnología Terminator: pertenece a GURT (acrónimo inglés de Genetic Use Restriction Technologies, Grupo de Tecnologías de Restricción de Uso). Terminator es el nombre coloquial con que se conocen los métodos propuestos para la restricción del uso de vegetales genéticamente modificados, por medio de obtener que la segunda generación de semillas devenga estéril.

Esta tecnología fue inicialmente desarrollada por el Departamento de Agricultura de EE. UU. y la Delta and Pine Company en los años 1990, y aún no fue incorporada a cultivares comerciales, y por supuesto no está autorizada su venta. Debido a que algunos inversionistas expresaron preocupación en que esta tecnología pudiese generar dependencia en los países más pobres, Monsanto, la compañía dedicada a la producción de bienes para usos agrícolas, consideró no comercializar esta tecnología, aun si llegase a estar comercialmente disponible.

Este tipo de GURT produce semillas estériles en el sentido en que un granjero que hubiese adquirido semillas que incorporen la tecnología V-GURT no tendría la posibilidad de guardar estas semillas de la cosecha con el propósito de una futura siembra. Esto no tendría un impacto inmediato sobre el amplio volumen de granjeros que utilizasen semillas híbridas, siendo que ellos no producirían sus propias semillas para fines de siembra, sino que comprarían semillas híbridas especiales de compañías especializadas. Esta tecnología actúa a nivel de la variedad de la planta: de ahí la ‘V’ del nombre V-GURT. Los productores de las cosechas genéticamente mejoradas utilizarían esta tecnología para proteger sus productos contra un uso no autorizado.

Posibles ventajas de la tecnología GURT

• Incentivos para el desarrollo de nuevas plantas: en territorios en que los sistemas de protección a la propiedad intelectual son ineficientes o aun inexistentes, los GURT podrían ser la alternativa para incentivar a las compañías biotécnicas al desarrollo de nuevas plantas.
• Administración mejorada de la granja: semillas inviables de plantas V-GURT reducirán la propagación de plantas de presencia espontánea. Estas plantas usualmente generan problemas económicos en los sistemas de granja de más grande y mecanizada escala que incluyen rotación de cultivos.
• Calidad mejorada del grano: bajo condiciones cálidas y húmedas de cosecha, el grano no-V-GURT puede germinar, lo que reduce la calidad final del total de grano producido. Se especula que este problema no habría de ocurrir con el uso de variedades de grano V-GURT.
• Seguridad biológica: la tecnología V-GURT puede impedir el escape de los transgenes hacia las variedades naturales originales, previniendo así todo impacto sobre la biodiversidad. Las cosechas modificadas para la producción de productos no alimenticios pueden estar equipadas con tecnología GURT que prevenga la transmisión accidental de estos rasgos a aquellas cosechas destinadas para alimentación.

4) Uso de vectores

Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados. Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

Tipos de vectores

Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen, entre otras.

• Plásmidos: fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.

• Bacteriófago lambda: el genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas. Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción; con la misma enzima de restricción se corta el fragmento de ADN de interés y se unen con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb (kilobases).
• Cósmidos: son vectores híbridos que utilizan partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica; además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.
• YAC: son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno. Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.
• BAC: es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad (factor F) de bacterias. El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana. Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.

Publicado por Luis Miguel Zuluaga en 17:41

Levadura

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Saccharomyces cerevisiae, levadura modelo.

Clasificación científica

• Dominio: Eucariota
• Reino: Fungi

Divisiones típicas

• Ascomycota
  • Saccharomycotina
  • Taphrinomycotina
    • Schizosaccharomycetes
• Basidiomycota
  • Pucciniomycetes
    • Sporidiales

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Levadura en polvo.

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Microfotografía de levadura.

Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediante fermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

Aunque en algunos textos de botánica se considera que las levaduras «verdaderas» pertenecen sólo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva microbiológica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetes.

A veces suelen estar unidas entre sí formando cadenas. Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azúcares.

Una de las levaduras más conocidas es la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma anaerobia^[1] realizando fermentación alcohólica.^[2] Por esta razón se emplea en muchos procesos de fermentación industrial, de forma similar a la levadura química, por ejemplo en la producción de cerveza, vino, hidromiel, aguamiel, pan, antibióticos, etc.

Las levaduras se reproducen asexualmente por gemación o brotación y sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. Durante la reproducción asexual, una nueva yema surge de la levadura madre cuando se dan las condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa de la madre al alcanzar un tamaño adulto. En condiciones de escasez de nutrientes, las levaduras que son capaces de reproducirse sexualmente formarán ascosporas. Las levaduras que no son capaces de recorrer el ciclo sexual completo se clasifican dentro del género Candida.

La levadura es la primera célula eucariota en la que se ha intentado expresar proteínas recombinantes debido a que es de fácil uso industrial: es barata, cultivarla es sencillo y se duplica cada 90 minutos en condiciones nutritivas favorables. Además, es un organismo fácil de modificar genéticamente, lo que permite realizar experimentos en varios días o semanas. Sin embargo, las levaduras poseen un mecanismo de glicosilación diferente al que se encuentra en células humanas, por lo que los productos son inmunogénicos.

Índice

• 1 Proceso de la fermentación de la levadura
• 2 Véase también
• 3 Referencias
• 4 Enlaces
• 5 Enlaces externos

Proceso de la fermentación de la levadura

La fermentación alcohólica es un proceso biológico de fermentación en ausencia de oxígeno (O2), originado por la actividad de algunos microorganismos como la levadura y bacterias, que procesan los azúcares (carbohidratos) como: glucosa, sacarosa, fructosa, entre otros. Los productos finales que se obtienen de este proceso son: etanol, dióxido de carbono, NAD+ y 2 ATP.

Existen 2 tipos de fermentación: alcohólica y láctica.

La fermentación alcohólica produce muy poca energía neta: 2 ATP por cada piruvato obtenido de la glicólisis. Como resultado se obtiene también etanol (principal producto utilizado en las empresas productoras de vinos, cervezas y vinagre) y dióxido de carbono (CO2).

La fermentación láctica ocurre en algunos protozoos y en tejidos animales. Su principal uso se da en la obtención de quesos, yogur, salsa de soya y otros productos derivados de la leche. En los tejidos animales se produce ácido láctico (o lactato) a partir del piruvato. En células musculares, cuando el suministro y las reservas de oxígeno (mioglobina) se agotan durante ejercicio físico extenuante, el piruvato deja de ingresar a las mitocondrias (ingresan en presencia de O2 para obtener energía) y comienza la fermentación láctica (anaerobia). Las grandes cantidades de lactato son las responsables de la fatiga y el dolor muscular.

Véase también

• Levadura química
• Levadura madre
• Levadura artificial

Referencias

1. «Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae. I. Ergosterol requirement for growth in a defined medium.» (en inglés). J Cell Physiol. 41 (1): pp. 23-36. Feb 1953. doi:1030410103. PMID 13034889. Consultado el 16 de octubre de 2008.
2. «The influence of some organic acids on the alcoholic fermentation in yeasts of the genus Saccharomyces.» (en inglés). Antonie Van Leeuwenhoek. 35 (Suppl): pp. G27-8. Jun 1969. PMID 5312005. Consultado el 16 de octubre de 2008.

Enlaces

Cocinando con Goizalde: Levaduras

Enlaces externos

• Wikimedia Commons alberga contenido multimedia sobre Levadura.

Categorías

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Fermentación

De Wikipedia, la enciclopedia libre

No debe confundirse con respiración anaeróbica.

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Fermentación alcohólica.

La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta, que no requiere oxígeno, y cuyo producto final es un compuesto orgánico. Según los productos finales, existen diversos tipos de fermentaciones.

«El vino es un mar de organismos. Merced a algunos vive, merced a otros se descompone.»

Louis Pasteur.^[1]

Fue descubierta por Louis Pasteur, que la describió como la vie sans l’air (la vida sin el aire). La fermentación típica es llevada a cabo por las levaduras. También algunos metazoos y protistas son capaces de realizarla.

El proceso de fermentación es anaeróbico, es decir, se produce en ausencia de oxígeno; ello significa que el aceptor final de los electrones del NADH producido en la glucólisis no es el oxígeno, sino un compuesto orgánico que se reducirá para poder reoxidar el NADH a NAD⁺. El compuesto orgánico que se reduce (acetaldehído, piruvato, …) es un derivado del sustrato que se ha oxidado anteriormente.

En los seres vivos, la fermentación es un proceso anaeróbico y en él no intervienen las mitocondrias ni la cadena respiratoria. El proceso de fermentación es característico de algunos microorganismos: algunas bacterias y levaduras. También se produce en la mayoría de las células de los animales (incluido el ser humano), excepto en las neuronas, que mueren rápidamente si no pueden realizar la respiración celular; algunas células, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias y se ven obligadas a fermentar; el tejido muscular de los animales realiza la fermentación láctica cuando el aporte de oxígeno a las células musculares no es suficiente para el metabolismo aerobio y la contracción muscular.

Desde el punto de vista energético, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la respiración aerobia, ya que a partir de una molécula de glucosa sólo se obtienen dos moléculas de ATP, mientras que en la respiración se producen de 36 a 38. Esto se debe a la oxidación del NADH que, en lugar de penetrar en la cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgánicos con poco poder oxidante.

En la industria, la fermentación puede ser oxidativa, es decir, en presencia de oxígeno, pero es una oxidación aerobia incompleta, como la producción de ácido acético a partir de etanol.

Índice

• 1 Usos
• 2 Tipos de fermentación
• 3 Véase también
• 4 Enlaces externos
• 5 Referencias

Usos

El beneficio industrial primario de la fermentación es la conversión del mosto en vino, de la cebada en cerveza y de los carbohidratos en dióxido de carbono para hacer pan. Otros usos de la fermentación son la producción de suplementos de vitamina B12, etc.

De acuerdo con Steinkraus (1995), la fermentación de los alimentos sirve a 5 propósitos generales:

• Enriquecimiento de la dieta a través del desarrollo de una diversidad de sabores, aromas y texturas en los sustratos de los alimentos.
• Preservación de cantidades substanciales de alimentos a través de ácido láctico, etanol, ácido acético y fermentaciones alcalinas.
• Enriquecimiento de sustratos alimenticios con proteína, aminoácidos, ácidos grasos esenciales y vitaminas.
• Detoxificación durante el proceso de fermentación alimenticia.
• Disminución de los tiempos de cocinado y de los requerimientos de combustible.

La fermentación tiene algunos usos exclusivos para los alimentos. Puede producir nutrientes importantes o eliminar antinutrientes. Los alimentos pueden preservarse por fermentación; la fermentación hace uso de energía de los alimentos y puede crear condiciones inadecuadas para organismos indeseables. Por ejemplo, al acidificar con el ácido producido por la bacteria dominante, se inhibe el crecimiento de todos los otros microorganismos.

De acuerdo al tipo de fermentación, algunos productos (p. ej., el alcohol fusel) pueden ser dañinos para la salud. En alquimia, la fermentación es a menudo lo mismo que putrefacción, significando permitir el pudrimiento o la descomposición natural de la sustancia.

Tipos de fermentación

Hay fermentación natural, cuando las condiciones ambientales permiten la interacción de los microorganismos y los sustratos orgánicos susceptibles, y artificial, cuando el ser humano propicia condiciones y el contacto referido.

Según el tipo de sustrato:

• Fermentación acética
• Fermentación alcohólica
• Fermentación butírica
• Fermentación láctica

Véase también

• Alimento fermentado

Enlaces externos

• Método para fermentar la fruta: fermentación de albaricoques.
• Fermentación homoláctica de la glucosa.
• Fermentación heteroláctica de la glucosa.

Referencias

1. Bronowski, J. (1973/1979). El ascenso del hombre (The Ascent of Man). Trad. Alejandro Ludlow Wiechers et al. Londres/Bogotá: BBC/Fondo Educativo Interamericano.

Categoría

• Fermentaciones