A. Introducción

Para el manejo y estudio de los microorganismos en el laboratorio son imprescindibles los medios de cultivo, los cuales se pueden definir como el sustrato óptimo para el desarrollo bacteriano. Son preparados sólidos, semisólidos o líquidos, elaborados en el laboratorio, constituyendo ambientes artificiales lo más semejantes posible a los ambientes naturales en los que se desenvuelven las bacterias. Se usan para evidenciar las bacterias, aislamiento de las mismas y para realizar estudios complementarios, tales como sensibilidad a ciertas sustancias, pruebas bioquímicas, etc.

B. Necesidades Nutricionales de las Bacterias

La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las sustancias químicas que necesitan para vivir. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se requieren para dos objetivos:

  • Fines energéticos (reacciones de mantenimiento)
  • Fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

Algunos nutrientes presentan solo una de estas funciones, mientras que otros pueden ejercer ambos papeles. Puesto que la nutrición presenta un aspecto de aprovisionamiento de energía y otro de suministro de materiales para la síntesis celular, podemos hablar de dos «clasificaciones» de tipos de nutrición:

1. Según la naturaleza de la fuente de energía, las bacterias se pueden dividir en:

  • a. Fototrofas: utilizan la energía solar.
  • b. Quimiotrofas: utilizan la energía resultante de reacciones químicas de oxidación-reducción. Dentro de ellas podemos distinguir:
    • Quimiolitotrofas: obtienen su energía de la oxidación de compuestos inorgánicos.
    • Quimioorganotrofas: obtienen su energía de la oxidación de compuestos orgánicos.

2. Según la naturaleza de la fuente principal de carbono, las bacterias se pueden dividir en:

  • a. Autótrofas: son aquellas cuya fuente de carbono es el CO2. Están dotadas de gran poder sintético, puesto que a partir de CO2, H2O y sales minerales, pueden sintetizar sus propios constituyentes orgánicos.
  • b. Heterótrofas: son incapaces de sintetizar sus propios componentes orgánicos partiendo de compuestos inorgánicos. Su fuente de carbono es orgánica (si bien otros elementos distintos del C pueden ser captados en forma inorgánica). De cualquier modo, entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono consiste en glucosa.

Fórmula global: C5H7O2N.

Otros elementos son menos abundantes que el C, O, H y N, pero son igualmente importantes para el conjunto del metabolismo. Estos incluyen el fósforo, potasio, calcio, magnesio, azufre, hierro, zinc, manganeso, cobre, molibdeno, cobalto y otros pocos elementos, dependiendo del organismo.

Para que las bacterias puedan vivir y reproducirse, además de unas condiciones físicas favorables, necesitan de la presencia de una serie de compuestos químicos. Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:

  1. Macronutrientes.
  2. Micronutrientes.
  3. Factores de crecimiento.

1. Macronutrientes

  • Carbono: la principal fuente de carbono son los hidratos de carbono.
  • Nitrógeno: la principal fuente de nitrógeno son las proteínas.
  • Hidrógeno y Oxígeno: las fuentes son todos los componentes que los contengan en su composición, tales como hidratos de carbono, proteínas, agua,…
  • Elementos minerales como fósforo, azufre, calcio, magnesio e hierro.

2. Micronutrientes o elementos traza

Zn, Co, Cu, Mn, Mo; se les denomina así porque son necesarios en cantidades muy pequeñas. No se suelen adicionar como tales, sino que van incorporados como impurezas de otras sustancias. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales forman parte de las enzimas.

3. Factores de crecimiento

En general, no todas las bacterias son capaces de crecer sobre medios donde se encuentran cubiertas las necesidades elementales. Existen bacterias que aún así no crecen en tales medios o, si lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que muchas bacterias no son capaces de fabricar por sí solas para su crecimiento. Este tipo de componentes se denominan factores de crecimiento. Entre ellos podemos citar:

  • Vitaminas
  • Bases púricas y pirimidínicas (precursores de ácidos nucleicos)
  • Factores X y V (presentes en la sangre)
  • Aminoácidos, etc.

C. Componentes de los Medios de Cultivo

1. Componentes Básicos

  • Agua: para asimilar los alimentos, las bacterias necesitan agua. También proporciona condiciones de humedad necesaria para la vida. El agua será destilada ya que la del grifo contiene calcio y magnesio que pueden formar precipitados con otros compuestos del medio de cultivo.
  • Peptonas: proteínas parcialmente hidrolizadas. Son fuente principalmente de nitrógeno, y también de carbono, azufre.
  • Extracto de carne o extracto de levadura: constituyen una fuente de carbono, nitrógeno, sales inorgánicas y factores de crecimiento.
  • Cloruro sódico: tiene como fin proporcionar un adecuado equilibrio osmótico. Incrementa la presión osmótica del medio para evitar la lisis de las bacterias.
  • Agentes solidificantes: los contienen los medios sólidos y semisólidos. El agar es el más usado, el cual es insoluble en agua fría y soluble en agua caliente. Funde a temperatura comprendida entre 80 y 100 ºC; una vez fundido permanece líquido hasta alrededor de los 44-45 ºC. Forma un gel muy transparente poco atacado por las bacterias. Presenta el inconveniente de que a pH ácido (pH óptimo para microorganismos tales como los hongos) solidifica con más dificultad.

2. Otros Componentes

  • Sustancias inhibidoras de crecimiento: son sustancias que impiden el crecimiento de los microorganismos que no nos interesan que se desarrollen. Entre éstas podemos citar colorantes como el cristal violeta, el verde brillante que inhiben a grampositivos; sales biliares que también inhiben a grampositivos; antibióticos, etc.
  • Indicadores: se utilizan para detectar variaciones en la acidez o alcalinidad del medio causadas por el metabolismo bacteriano. Estas variaciones se aprecian por el cambio de color del indicador. Los más frecuentes son:
  • Aditivos: son sustancias que se añaden para favorecer el crecimiento de ciertos microorganismos que son más exigentes. Ej: suero, leche, sangre, huevo, infusiones de hígado, cerebro y corazón.
  • Agentes reductores: se añaden a los medios para promover la anaerobiosis. Entre los más empleados están: tioglicolato sódico, cisteína, ácido ascórbico.
  • Hidratos de carbono: sobre todo mono y disacáridos; se pueden adicionar con fines de nutrición o para realizar pruebas de identificación bioquímica.
  • Sales minerales: sulfatos y fosfatos de calcio, potasio, magnesio, hierro, etc.
  • Tampones estabilizadores del pH: se utilizan estas sustancias ya que el pH puede variar durante el proceso de preparación del medio como consecuencia de la acumulación de los productos del metabolismo bacteriano.

D. Normas Generales para la Preparación de un Medio de Cultivo

Los medios de cultivo se comercializan desecados, en forma de polvo, para su disolución y esterilización. Actualmente se pueden adquirir también medios sólidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se funden mediante ebullición y se dispensan en placas; medios en tubos y medios sólidos en placa, listos para su inoculación. Aunque esta última práctica se ha extendido enormemente facilitando el trabajo rutinario, conviene conocer las operaciones necesarias para preparar un medio de cultivo en buenas condiciones. Para ello seguiremos los siguientes pasos:

  1. Leer las instrucciones: aunque la mayoría de los medios se prepara de igual forma, hay algunos que tienen normas específicas de preparación. En concreto, hay medios de cultivo que no se pueden esterilizar, a otros hay que añadirle alguna sustancia, etc.
  2. Pesada de los componentes: actualmente se suele disponer de la mayoría de los medios de cultivo deshidratados, por lo que no es necesario pesar uno por uno cada uno de los componentes.
  3. Disolución de los componentes: se realizará con agua destilada y en recipientes de vidrio. Se calentará lo necesario para la total disolución (imprescindible en medios sólidos y semisólidos), debiendo quedar el medio totalmente homogéneo. El recipiente donde se disuelvan los componentes debe ser de mayor volumen que el correspondiente al del medio que se quiere preparar, así para preparar 250 ml de medio no se usará un matraz de 250 sino uno de 500 ml.
  4. Ajuste del pH: para determinar el pH de los medios de cultivo suele ser suficiente con el uso de papeles indicadores de escala fraccionada. Normalmente los medios deshidratados llevan ajustado el pH. Si fuera necesario ajustarlo se hará con una solución no muy concentrada de ácido (Ej.: HCl) para acidificar o de base (Ej.: NaOH) para alcalinizar, ambas de concentración conocida.
  5. Reparto en recipientes adecuados: si el medio preparado se va a utilizar en tubos o frascos, se repartirá en estos con ayuda de un dosificador o pipeta; a continuación se les pondrá un tapón y una vez rotulados se dispondrán en gradillas o cestillos de autoclave y se procederá a su esterilización. Si el medio se fuera a repartir en placas de Petri, se esterilizará en el matraz donde se hubiese preparado y posteriormente se repartirá ante mechero en placas estériles.
  6. Esterilización: se suele realizar en autoclave de vapor a 1 atm de sobrepresión (121 ºC), durante 15-20 minutos, o bien a 1/2 atm de sobrepresión (112 ºC) durante 30 minutos. En caso de medios de cultivo que no se puedan esterilizar a estas temperaturas, se recurrirá a la filtración esterilizante o bien a la tindalización. Si los tubos esterilizados contienen medio de cultivo sólido y se van a utilizar en forma de pico de flauta, una vez sacados del autoclave se apoyan sobre una varilla o similar y se dejan solidificar. Igualmente, una vez repartido el medio en placas de Petri, se dejará que solidifique antes de guardarlas.
  7. Comprobación de la esterilidad de los medios: se puede hacer incubando una placa o tubo, de los preparados, a 37 ºC durante 48 horas al menos y comprobando que no haya crecimiento. Además se pueden emplear periódicamente controles químicos, físico-químicos y biológicos del proceso de esterilización en el autoclave de vapor.
  8. Conservación de los medios: es necesario evitar la desecación de los medios sólidos y la evaporación de los líquidos, ya que esto alteraría su composición. Esto se consigue mediante un cierre lo más hermético posible. Así, se puede contribuir a esto recubriendo los tapones de algodón de los tubos con papel parafinado, o bien utilizando tapones de caucho, de papel de aluminio, de rosca. Los tubos con tapones de algodón o capuchón metálico se pueden conservar aproximadamente durante un mes; si el cierre es hermético (tapones de rosca) el tiempo de conservación es mucho más largo. Las placas de Petri (introducidas en bolsas de plástico e invertidas), no se pueden conservar durante mucho tiempo, una semana en frigorífico y algo más con los bordes pegados con papel adhesivo. Además deben estar perfectamente rotuladas en su base. La calidad final del medio de cultivo preparado depende de la forma en que se prepara, por lo que es de real importancia que se sigan las normas expuestas anteriormente. Los medios se guardarán en frigorífico, debiendo sacarse de éste y dejándolos atemperar antes de proceder a su utilización.

E. Clasificación de los Medios de Cultivo

Se pueden clasificar atendiendo a diversos criterios:

1. Atendiendo a su estado físico

  • a) Líquidos: son los más favorables para el desarrollo y multiplicación de las bacterias porque al difundirse por toda la masa del medio encuentran fácilmente los nutrientes necesarios para su vida. También se contaminan más fácilmente. No contienen agar. Ej.: Agua de peptona.
  • b) Sólidos: contienen de 15 a 17 g de agar por litro. En ellos las bacterias crecen con mayor dificultad pues los materiales nutritivos se agotan rápidamente en el punto donde se desarrolla el crecimiento. Sin embargo, son indispensables para aislar, observar morfología colonial, hemólisis, etc. Ej.: agar nutritivo. Cuando se quiere reactivar el desarrollo de un microorganismo cultivado en un medio sólido, se resiembra en medio líquido.
  • c) Semisólidos: en ellos el agar se encuentra en menor proporción que en los sólidos, de 3 a 5 g/litro. Tienen especial aplicación para el estudio de la movilidad bacteriana.

2. Atendiendo a su utilidad

  • a) Generales o comunes: son aquellos en los que crecen gran número de microorganismos. Se usan para cultivar bacterias poco exigentes. Entre los sólidos tenemos el Agar nutritivo y el TSA y entre los líquidos caldo nutritivo y el TSB. El caldo nutritivo tiene la misma composición a excepción del agar.
  • b) Medios especiales: conocidos también como específicos, van dirigidos al cultivo de determinadas especies bacterianas o son utilizados con fines de diferenciación. Entre ellos podemos citar:
    • b.1. Enriquecidos: son medios generales a los que se les añade ciertos productos (sangre, suero, glucosa,…), favoreciendo así el crecimiento de ciertos microorganismos muy exigentes. Ejemplos: Agar-glucosa (agar nutritivo añadido de glucosa), Agar sangre (agar nutritivo añadido de sangre), Agar chocolate, Agar tioglicolato, etc.
    • b.2. Diferenciales o de Identificación: son aquellos en los que además de crecer las bacterias, al actuar éstas sobre alguno de los componentes específicos del medio, demuestran alguna de sus propiedades bioquímicas. Algunos de ellos contienen azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica conocida (si la bacteria es capaz de fermentar el azúcar que lleva el medio, se producirá una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del medio por el cambio de pH). Ejemplos: Agar hierro de Kligler, Agar de MacConkey (diferencia los bacilos entéricos fermentadores y no fermentadores de la lactosa.
      • Fermentadores de lactosa (lactosa positivos) —> colonias rosas
      • No fermentadores de lactosa (lactosa negativos) —> colonias incoloras
    • b.3. Selectivos: son aquellos en los que, mediante la adición de determinadas sustancias (sales biliares, antibióticos, etc.), se consigue inhibir por completo el crecimiento de bacterias distintas de la que se quiere aislar y que están presentes en la muestra. Suelen ser sólidos. Ejemplos: Agar- MacConkey (se utiliza para el aislamiento de Enterobacterias) ; Agar Salmonella-Shigella (agar SS, selectivo para Salmonella y Shigella ); Agar Manitol salado-Chapman (selectivo de Estafilococos).
    • b.4. Medios de enriquecimiento: inhiben el crecimiento de unos microorganismos y además favorecen el de otros. Suelen ser líquidos. Ejemplos: Agua de peptona alcalina (pH = 8,4 en la que gracias a este pH se favorece el crecimiento del Vibrio cholerae.), Caldo selenito (favorece el crecimiento de Salmonella y Shigella, fundamentalmente Salmonella).
    • b.5. Medios de transporte: son aquellos que tienen por objeto mantener en estado viable, aunque sin reproducción (o mínimamente), los microorganismos presentes en una muestra, permitiendo posteriormente recuperar incluso a los que están minoritariamente presentes. Se utilizan para asegurar la viabilidad de las bacterias desde el momento de la toma de las muestras hasta su posterior siembra en el laboratorio o para su envío de unos laboratorios a otros. Actualmente los medios de transporte más utilizados son los de Stuart, Amies, y el medio de Cary-Blair.
    • b.6. Medios de conservación: son una variación de los medios de transporte. Aseguran las características morfológicas y fisiológicas de las bacterias por un período largo de tiempo. Ejemplo: Agar de tripticasa y soja.